Préparation des boîtes de microinjection
Ces boîtes vont être techniquées assez longtemps dans des conditions hostiles.
Pour ces raisons, leur constitution pourra varier d'un utilisateur à l'autre en fonction de la rapidité
d'éxécution des micro-manipulations.
Pour une bonne tenue du pH, Il sera préférable d'utiliser des milieux de culture comportant un tampon HEPES, plutôt qu'un tampon
carbonate.
Le nombre d'ovocytes à injecter dans la même boîte pourra varier de 3 à 8, selon la dextérité de l'utilisateur.
Ces boîtes sont préparées 2 heures environ avant utilisation sous huile, de manière à être gazées convenablement
et à 37°C. avant utilisation.
I Technique avec microgoutte de PVP.
Une goutte de milieu de culture est faite pour recevoir un échantillon de sperme provenant d'une sélection effectuée à partir d'un swim-up ou d'une technique par gradient de concentration.
Les spermes les plus mobiles vont alors se retrouver à la périphérie de la goutte. Ils seront sélectionnés et prélevès
avec la micropipette de micro-injection puis transportés dans le PVP avant d'être injectés dans les ovocytes
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II Technique avec pont liquidien.
le PVP est élalé en rectangle, à raison de 8 microlitres sur 1,5 cm2 environ, de manière à obtenir une couche
relativement fine.
Une très petite goutte de milieu de culture (3-4 ul) est déposée à environ 0,5 cm du PVP. On etabli ensuite, avec
l'embout du cône jaune un pontage entre la goutte de milieu de culture et le PVP.
Une fois recouverte d'huile, la boîte est incubée 2 heures à 37°C. sous 5% de CO2, avant utilisation.
Les spermatozoïdes seront déposés sur l'empreinte de la goutte de milieu de culture qui est à l'origine du pont liquidien.
Ils migreront alors d'un milieu très fluide vers un milieu plus visqueux, en suivant, pour les meilleurs d'entre eux, le
bord du PVP.
Après injection, les ovocytes seront lavés dans un milieu sans HEPES avant d'être mis en culture.
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