|
LES PRINCIPES GENERAUX :
Les conditions de cultures des gamètes et des embryons sont asservies à un certain nombre d'impératifs:
La température :
Elle devra être maintenue en permanence et dans la mesure du possible à 37°C, en évitant les chutes brutales de température.
La hotte à flux laminaire à platine chauffante intégrale type "K-systems*" est un moyen pour y parvenir,
mais il existe d'autres solutions possibles : en utilisant à chaque étape de la manipulation des platines chauffantes intégrées au matériel
(loupe binoculaire,microscope, incubateur de paillasse sous hotte....etc.
La température des incubateurs sera régulièrement vérifiée avec un thermomètre de référence, et ajustée si besoin.
On pourra, à l'occasion, utiliser des pastilles adhésives à cristaux liquides permettant de donner une indication approchée de la
température d'une surface thermostatée, par exemple, et qui permettra surtout de dépister les gros dysfonctionnements.
En ce qui concerne le maintien de la température , au cours de la manipulation par microinjection, la platine "Intégra", adaptable à la
grande majorité des microscopes inversés du marché est probablement,aujourd'hui, l'une des mieux adaptées aux besoins ergonomiques:
La stérilité :
Elle est assurée par l'espace se trouvant sous la hotte à flux laminaire. Pour des questions pratiques (microinjection des ovocytes), il
sera parfois nécessaire d'équiper la hotte d'un système anti-vibratoire (voir hotte "K-system*"au dessus)
Le pH :
Il devra être maintenu en permanence entre 7,2 et 7,4 tout au cours des manipulations.
Les tampons phosphates et surtout bicarbonates sont utilisés couramment pour les cultures. Le tampon carbonates/acide carbonique
impose une étuve parfaitement réglée en mélange gazeux. (5% en CO2).
Pour des manipulations un peu plus longues il est possible d''utiliser des tampons HEPES. Toutefois, après manipulation, il sera
nécessaire d'éliminer ce tampon en lavant soigneusement les gamètes ou les embryons dans un milieu conventionnel.
La pression partielle en Oxygène et en CO2 :
- les incubateurs à CO2 : Galaxy R6 et Mini galaxy
voir aussi : Contrôle de l'environnement du laboratoire d'AMP
|
|
On peut utiliser un mélange gazeux contenant de l'oxygène, du CO2 et de l''azote. Un mélange "adapté" à chaque situation
peut être obtenu par un incubateur "tri-gaz", mais il faut bien reconnaitre que la majorité des centres utilise l'air ambiant comme source
de gaz, ajusté à 5% de CO2 (voir 6% en cas d'utilisation intense). Dans ces incubateurs le pourcentage d'oxygène se situe autour de 20%
L'osmolarité :
Elle dépend de 2 facteurs essentiels :
à l'extérieur de l'étuve : elle dépend du temps de manipulation, une manipulation longue devra donc être effectuée :
- soit avec un volume de milieu de culture suffisant pour minimiser les effets de l'évaporation (600-1000 ul)
- soit sous huile, ce qui permet d'utiliser des petits volumes de milieux de culture (10-30 ul).
à l'intérieur de l'étuve : elle dépend de son degré hygrométrique, assuré par une réserve d'eau stérile.
L'homéostasie :
Pour obtenir la constance de l'ensemble de ces paramètres au sein des incubateurs, il est primordial de les ouvrir le moins souvent
possible et, donc de disposer de plusieurs incubateurs attribués à des tâches homogènes.
Il est aussi possible de compartimenter les incubateurs soit par un système d'ouverture multiple pouvant garantir un ralentissement des
variations à l'ouverture, soit isoler, par exemple, sous cloche, les cultures fragiles.
L'environnement :
On évitera d'utiliser tout produit (produit de nettoyage et d'hygiène (spray et bombe anti-odeur), solvant, peinture, alcool, sans s'être assuré
de leur neutralité sur le processus de fécondation ou le développement des embryons.
On préfèrera le matériel stérilisé aux rayons gamma et on proscrira, autant que faire se peut, le matériel stérilisé à l'oxyde d'éthylène qui,
s'il est utilisé devra être rincé systématiquement avec un liquide isotonique et chaud (37°c.).
On s'assurera aussi qu'il n'existe pas de bouche d'évacuation d'air vicié aux abords du laboratoire.
La qualité de l'air :
Dans certains sites exposés, il y aura nécessité d'améliorer la qualité de l'air en utilisant des tours filtrantes - Tours CODA*,
voir aussi : Contrôle de l'environnement du laboratoire d'AMP
dans d'autres cas de figures, des filtres CODA*, branchés en série sur les tuyaux d'alimentation de gaz suffiront.
Ces tours ont deux types d'actions :
- Elles filtrent les particules solides et les micro-organismes.
- Elles filtrent les composés organiques volatils (COV) dont certains ont des actions très délétères sur la cultures embryonnaires
- ( voir chapitre Les problèmes rencontrés )
Les réactifs et milieux de culture :
Ils sont, pour la plupart, conservés autour de 4°C. au réfrigérateur, leur date d'ouverture est notifiée sur chaque flacon pour pouvoir
assurer son utilisation dans le cadre des dates limites fournies par le fabricant.
Avant toute utilisation, ils doivent être équilibrés en CO2 et incubés à 37°C, le temps necessaire (de 2 a 12 heures suivant les cas).
En revanche, les milieux contenant de l'hépès doivent être pré-incubés dans une étuve de précision (+ ou - 0,2°C.) à 37°C. sans CO2
Les Laboratoires JCD sont à même de vous fournir un choix unique de produits de qualité constante, reconnu par les professionnels de l'assistance biologique à la reproduction humaine.
|
|
|
